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原理或術(shù)語(yǔ)
光譜法（spectrometry）是基于物質(zhì)與電磁輻射作用時(shí)，測(cè)量由物質(zhì)內(nèi)部發(fā)生量子化的能級(jí)之間的躍遷而產(chǎn)生的發(fā)射、吸收或散射輻射的波長(zhǎng)和強(qiáng)度進(jìn)行分析的方法。光譜法可分為發(fā)射光譜法、吸收光譜法、散射光譜法;或分為原子光譜法和分子光譜法;或分為能級(jí)譜，電子、振動(dòng)、轉(zhuǎn)動(dòng)光譜，電子自旋及核自旋譜等。
分光光度法是光譜法的重要組成部分，是通過(guò)測(cè)定被測(cè)物質(zhì)在特定波長(zhǎng)處或一定波長(zhǎng)范圍內(nèi)的吸光度或發(fā)光強(qiáng)度，對(duì)該物質(zhì)進(jìn)行定性和定量分析的方法。常用的技術(shù)包括紫外-可見(jiàn)分光光度法、紅外分光光度法、熒光分光光度法和原子吸收分光光度法等。
紫外-可見(jiàn)分光光度法是在190~800nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)測(cè)定物質(zhì)的吸光度，用于鑒別、雜質(zhì)檢查和定量測(cè)定的方法。
常用檢測(cè)儀器:紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)。
原理如下 :
單色光輻射穿過(guò)被測(cè)物質(zhì)溶液時(shí)，在一定的濃度范圍內(nèi)被該物質(zhì)吸收的量與該物質(zhì)的濃度和液層的厚度（光路長(zhǎng)度）成正比，其關(guān)系可以用朗伯-比爾定律表述如下:
式中
A為吸光度;
T為透光率;
E為吸收系數(shù)，常用的表示方法 ，其物理意義為當(dāng)溶液濃度為1%（g/ml）,液層厚度為1cm時(shí)的吸光度數(shù)值;
c為100ml溶液中所含物質(zhì)的重量（按干燥品或無(wú)水物計(jì)算），g;
l（L）為液層厚度，cm。
上述公式中吸收系數(shù)也可以摩爾吸收系數(shù)ε來(lái)表示，其物理意義為溶液濃度c為1mol/L和液層厚度為1cm時(shí)的吸光度數(shù)值。在最大吸收波長(zhǎng)處摩爾吸收系數(shù)表示為εmax。
物質(zhì)對(duì)光的選擇性吸收波長(zhǎng)，以及相應(yīng)的吸收系數(shù)是該物質(zhì)的物理常數(shù)。在一定條件下，物質(zhì)的吸收系數(shù)是恒定的，且與入射光的強(qiáng)度、吸收池厚度及樣品濃度無(wú)關(guān)。當(dāng)已知某純物質(zhì)在一定條件下的吸收系數(shù)后，可用同樣條件將該供試品配成溶液，測(cè)定其吸光度，即可由上式計(jì)算出供試品中該物質(zhì)的含量。在可見(jiàn)光區(qū)，除某些物質(zhì)對(duì)光有吸收外，很多物質(zhì)本身并沒(méi)有吸收，但可在一定條件下加入顯色試劑或經(jīng)過(guò)處理使其顯色后再測(cè)定，故又稱之為比色分析。
分光光度計(jì)
紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)由5個(gè)部件組成:①輻射源。必須具有穩(wěn)定的、有足夠輸出功率的、能提供儀器使用波段的連續(xù)光譜，如鎢燈、鹵鎢燈（波長(zhǎng)范圍350~2500納米），氘燈或氫燈（180~460納米），或可調(diào)諧染料激光光源等。②單色器。它由入射、出射狹縫、透鏡系統(tǒng)和色散元件（棱鏡或光柵）組成，是用以產(chǎn)生高純度單色光束的裝置，其功能包括將光源產(chǎn)生的復(fù)合光分解為單色光和分出所需的單色光束。③試樣容器，又稱吸收池。供盛放試液進(jìn)行吸光度測(cè)量之用，分為石英池和玻璃池兩種，前者適用于紫外到可見(jiàn)區(qū)，后者只適用于可見(jiàn)區(qū)。容器的光程一般為0.5~10厘米。④檢測(cè)器，又稱光電轉(zhuǎn)換器。常用的有光電管或光電倍增管，后者較前者更靈敏，特別適用于檢測(cè)較弱的輻射。近年來(lái)還使用光導(dǎo)攝像管或光電二極管矩陣作檢測(cè)器，具有快速掃描的特點(diǎn)。⑤顯示裝置。這部分裝置發(fā)展較快。較高級(jí)的光度計(jì)，常備有微處理機(jī)、熒光屏顯示和記錄儀等，可將圖譜、數(shù)據(jù)和操作條件都顯示出來(lái)。
儀器類型則有:單波長(zhǎng)單光束直讀式分光光度計(jì)，單波長(zhǎng)雙光束自動(dòng)記錄式分光光度計(jì)和雙波長(zhǎng)雙光束分光光度計(jì)。
應(yīng)用范圍包括:①定量分析，廣泛用于各種物料中微量、超微量和常量的無(wú)機(jī)和有機(jī)物質(zhì)的測(cè)定。②定性和結(jié)構(gòu)分析，紫外吸收光譜還可用于推斷空間阻礙效應(yīng)、氫鍵的強(qiáng)度、互變異構(gòu)、幾何異構(gòu)現(xiàn)象等。③反應(yīng)動(dòng)力學(xué)研究，即研究反應(yīng)物濃度隨時(shí)間而變化的函數(shù)關(guān)系，測(cè)定反應(yīng)速度和反應(yīng)級(jí)數(shù)，探討反應(yīng)機(jī)理。④研究溶液平衡，如測(cè)定絡(luò)合物的組成，穩(wěn)定常數(shù)、酸堿離解常數(shù)等。
儀器校正檢定
1. 波長(zhǎng)
由于環(huán)境因素對(duì)機(jī)械部分的影響，儀器的波長(zhǎng)經(jīng)常會(huì)略有變動(dòng)，因此除應(yīng)定期對(duì)所用的儀器進(jìn)行全面校正檢定外，還應(yīng)于測(cè)定前校正測(cè)定波長(zhǎng)。常用汞燈中的較強(qiáng)譜線237.83nm，253.65nm，275.28nm，296.73nm，313.16nm，334.15nm，365.02nm，404.66nm，435.83nm，546.07nm與576.96nm;或用儀器中氘燈的486.02nm與656.10nm譜線進(jìn)行校正;鈥玻璃在波長(zhǎng)279.4nm，287.5nm，333.7nm，360.9nm，418.5nm，460.0nm，484.5nm，536.2nm與637.5nm處有尖銳吸收峰，也可作波長(zhǎng)校正用，但因來(lái)源不同或隨著時(shí)間的推移會(huì)有微小的變化，使用時(shí)應(yīng)注意;近年來(lái)，常使用高氯酸鈥溶液校正雙光束儀器，以10%高氯酸溶液為溶劑，配制含氧化鈥（Ho203）4%的溶液，該溶液的吸收峰波長(zhǎng)為241.13nm，278.10nm，287.18nm，333.44nm，345.47nm，361.31nm，416.28nm，451.30nm，485.29nm，536.64nm 和640.52nm。
儀器波長(zhǎng)的允許誤差為:紫外光區(qū)±1nm，500nm附近±2nm。
2.吸光度的準(zhǔn)確度
可用重鉻酸鉀的硫酸溶液檢定。取在120℃干燥至恒重的基準(zhǔn)重鉻酸鉀約60mg，精密稱定，用0.005mol/L硫酸溶液溶解并稀釋至1000ml，在規(guī)定的波長(zhǎng)處測(cè)定并計(jì)算其吸收系數(shù)，并與規(guī)定的吸收系數(shù)比較，應(yīng)符合表中的規(guī)定。（）中未顯示公式吸收系數(shù) 。
波長(zhǎng)/nm | 235（最?。?/strong> | 257（最大） | 313（最小） | 350（最大） |
吸收系數(shù)（ ）的規(guī)定值 | 124.5 | 144.0 | 48.6 | 106.6 |
吸收系數(shù)（ ）的許可范圍 | 123.0~ 126.0 | 142.8~ 146.2 | 47.0~ 50.3 | 105.5~ 108.5 |
3.雜散光的檢查
可按下表所列的試劑和濃度，配制成水溶液，置1cm石英吸收池中，在規(guī)定的波長(zhǎng)處測(cè)定透光率，應(yīng)符合表中的規(guī)定。
試劑 | 濃度/%（g/ml） | 測(cè)定用波長(zhǎng)/nm | 透光率/% |
碘化鈉 | 1.00 | 220 | <0.8 |
亞硝酸鈉 | 5.00 | 340 | <0.8 |
對(duì)溶劑要求
含有雜原子的有機(jī)溶劑，通常均具有很強(qiáng)的末端吸收。因此，當(dāng)作溶劑使用時(shí)，它們的使用范圍均不能小于截止使用波長(zhǎng)。例如甲醇、乙醇的截止使用波長(zhǎng)為205nm 。另外，當(dāng)溶劑不純時(shí)，也可能增加干擾吸收。因此，在測(cè)定供試品前，應(yīng)先檢查所用的溶劑在供試品所用的波長(zhǎng)附近是否符合要求，即將溶劑置1cm石英吸收池中，以空氣為空白（即空白光路中不置任何物質(zhì)）測(cè)定其吸光度。溶劑和吸收池的吸光度，在220~240nm 范圍內(nèi)不得超過(guò)0.40，在241~250nm范圍內(nèi)不得超過(guò)0.20，在251~300nm范圍內(nèi)不得超過(guò)0.10，在300nm以上時(shí)不得超過(guò)0.05。
測(cè)定法
測(cè)定時(shí)，除另有規(guī)定外，應(yīng)以配制供試品溶液的同批溶劑為空白對(duì)照，采用1cm的石英吸收池，在規(guī)定的吸收峰波長(zhǎng)±2nm以內(nèi)測(cè)試幾個(gè)點(diǎn)的吸光度，或由儀器在規(guī)定波長(zhǎng)附近自動(dòng)掃描測(cè)定，以核對(duì)供試品的吸收峰波長(zhǎng)位置是否正確，除另有規(guī)定外，吸收峰波長(zhǎng)應(yīng)在該品種項(xiàng)下規(guī)定的波長(zhǎng)±2nm以內(nèi)，并以吸光度最大的波長(zhǎng)作為測(cè)定波長(zhǎng)。一般供試品溶液的吸收度讀數(shù)，以在0.3~0.7之間為宜。儀器的狹縫波帶寬度宜小于供試品吸收帶的半寬度的十分之一，否則測(cè)得的吸光度會(huì)偏低;狹縫寬度的選擇，應(yīng)以減小狹縫寬度時(shí)供試品的吸收度不再增大為準(zhǔn)，由于吸收池和溶劑本身可能有空白吸收，因此測(cè)定供試品的吸光度后應(yīng)減去空白讀數(shù)，或由儀器自動(dòng)扣除空白讀數(shù)后再計(jì)算含量。
當(dāng)溶液的pH值對(duì)測(cè)定結(jié)果有影響時(shí)，應(yīng)將供試品溶液的pH值和對(duì)照品溶液的pH值調(diào)成一致。
1. 鑒別和檢查 分別按各品種項(xiàng)下規(guī)定的方法進(jìn)行。
2. 含量測(cè)定 一般有以下幾種方法。
（1）對(duì)照品比較法
按各品種項(xiàng)下的方法，分別配制供試品溶液和對(duì)照品溶液，對(duì)照品溶液中所含被測(cè)成分的量應(yīng)為供試品溶液中被測(cè)成分規(guī)定量的100%±10%，所用溶劑也應(yīng)完quan一致，在規(guī)定的波長(zhǎng)測(cè)定供試品溶液和對(duì)照品溶液的吸光度后，按下式計(jì)算供試品中被測(cè)溶液的濃度∶
cx=（Ax/Ar）cr
式中 cx為供試品溶液的濃度;
Ax為供試品溶液的吸光度;
cr為對(duì)照品溶液的濃度;
Ar為對(duì)照品溶液的吸光度。
（2）吸收系數(shù)法
按各品種項(xiàng)下的方法配制供試品溶液，在規(guī)定的波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度，再以該品種在規(guī)定條件下的吸收系數(shù)計(jì)算含量。用本法測(cè)定時(shí)，吸收系數(shù)通常應(yīng)大于100，并注意儀器的校正和檢定。
（3）計(jì)算分光光度法
計(jì)算分光光度法有多種，使用時(shí)應(yīng)按各品種項(xiàng)下規(guī)定的方法進(jìn)行。當(dāng)吸光度處在吸收曲線的陡然上升或下降的部位測(cè)定時(shí)，波長(zhǎng)的微小變化可能對(duì)測(cè)定結(jié)果造成顯著影響，故對(duì)照品和供試品的測(cè)試條件應(yīng)盡可能一致。計(jì)算分光光度法一般不宜用作含量測(cè)定。
（4）比色法
供試品本身在紫外-可見(jiàn)光區(qū)沒(méi)有強(qiáng)吸收，或在紫外光區(qū)雖有吸收但為了避免干擾或提高靈敏度，可加入適當(dāng)?shù)娘@色劑，使反應(yīng)產(chǎn)物的最大吸收移至可見(jiàn)光區(qū)，這種測(cè)定方法稱為比色法。
用比色法測(cè)定時(shí)，應(yīng)取數(shù)份梯度量的對(duì)照品溶液，用溶劑補(bǔ)充至同一體積，顯色后，以相應(yīng)試劑為空白，在各品種規(guī)定的波長(zhǎng)處測(cè)定各份溶液的吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，再根據(jù)供試品的吸光度在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得其相應(yīng)的濃度，并求出其含量。
也可取對(duì)照品溶液與供試品溶液同時(shí)操作，顯色后，以相應(yīng)的試劑為空白，在各品種規(guī)定的波長(zhǎng)處測(cè)定對(duì)照品和供試品溶液的吸光度，按上述（1）法計(jì)算供試品溶液的濃度。
紫外-可見(jiàn)分光光度法
除另有規(guī)定外，比色法所用空白系指用同體積溶劑代替對(duì)照品或供試品溶液，然后依次加入等量的相應(yīng)試劑，并用同樣方法處理制得。
參考資料
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